细胞计数方法存在的问题与解决办法

1. 细胞计数的意义
计数细胞是了解细胞数量变化的基本方法，细胞数量变化是细胞生理功能表现的重要指标，准确的细胞数量变化提供准确的功能信息，错误的细胞数量变化提供错误的功能信息。所以细胞计数准确性决定细胞生理学研究的成功与失败。

2. 细胞计数要解决的问题
细胞计数的目的是确定细胞样本中的细胞数量，一般是指单位体积内的细胞数量，如1升血样本中含有多少个红细胞，多少个白细胞；细胞学实验经常需要比较细胞处理前后的数量变化。计数细胞就是确定细胞样本处理前后每单位样本中含有多少个细胞，即单位体积内的细胞数。

3. 现行细胞计数仪器和计数方法存在的问题
 现在计数细胞的仪器和方法不少，但计数准确度都不高，达不到细胞学研究要求的水平。原因出在细胞计数仪设计师对细胞计数的目的要求和细胞计数操作过程，认识不够清楚，设计的仪器结构原理有问题。以细胞计数板为例，细胞计数板的结构不太合理。细胞计数板的结构是在一片玻璃板上蚀刻出一个细胞计数池，呈方形，边长1mm,深度0.1mm，容积是0.1mm³=0.1微升=万分之一毫升，底面用线分割成方格。计数板计数的细胞数准确度没有问题，刻蚀的容积也没有问题，问题出在使用方法。细胞计数的时候，计数池上面加了一个盖玻片，细胞样本是从计数板与盖玻片之间的缝隙中加进去的。细胞液充满计数池和计数池与盖玻片之间的空隙，这个空隙中的细胞也进入计数池。因此计数的细胞体积应该是计数池的体积加上空隙体积。空隙体积是多大，不知道，计算细胞密度的时候都不计算内，被忽略掉了，所以细胞计数板计数的细胞密度不准确。缝隙体积很小，但相对于只有0.1微升的计数池体积，影响是很大的，可能达到15%或更大，所以是不可以忽略掉的。计数池容积太小和加盖玻片是细胞计数板的致命伤。

细胞计数板是细胞计数方法，优点是简单、方便，计数细胞真实，数量准确。缺点是计量体积不准确，计数结果不准确，另外计数的细胞无法回收使用和细胞数量少于10万的样本无法计数也是问题。

细胞自动计数分析仪(Cellometer )是最近推出来的细胞计数方法。Cellometer的问题比较大。Cellometer是基于图像分析的细胞计数仪。计数原理类似与血球计数板，只是用仪器摄像代替人眼观察细胞计数。加20ml样本到计数仪计数板的样品室内，使细胞平铺为单层细胞，将计数板放入计数仪内，通过仪器摄像头选择一个视野，记录视野内的细胞。该仪器的细胞计数方法没有记录样品室内的全部细胞，只是选取样品室内细胞分布的一个视野进行计数。仪器设定的视野面积近似于血球计数板一个白细胞计数单位的面积，没有考虑样品深度，而且显微镜视野面积受放大倍数影响，面积和深度都不确定，体积更是问题，体积不准确，计数出来的细胞浓度不会准确。因此Cellometer细胞计数方法可信度很低。

流式细胞计数仪，以B.Dtc20-automated-cell-counter 为例，是临床医学应用比较多的细胞计数方法。这是一种基于库尔特原理的细胞计数仪。库尔特原理认为，悬浮在电解液中的颗粒随电解液通过小孔管时，取代相同体积电解液，导致小孔管内外两电极间电阻发生瞬时变化，产生电位脉冲，脉冲信号的大小和次数与颗粒的大小和数目成正比。这类细胞计数仪是根据细胞通过小孔引起电位变化计算细胞个数。仪器根据细胞体积大小设定脉冲信号上下限，在上下限之间的颗粒信号作为细胞记录，大于上限和小于下限的颗粒信号不作为细胞记录，与颗粒的颜色、形状、性质无关。这种计数方法不能区分细胞与非细胞颗粒，体积与细胞大小相同的非细胞颗粒也作为细胞记录下来，非细胞颗粒造成假阳性细胞，大于和小于设定孔径的细胞不作细胞计数造成假阴性。这类细胞计数仪的优点是，自动化程度高，快速方便，样本体积计量准确；主要问题是存在假阳性和假阴性问题，误差比较大，计数的细胞密度准确度或真实性不高，而且检测的细胞数量不能太少，细胞不能回收使用。该方法用于临床检验（要求准确度不高）还可以，但不适合细胞学实验。

4. 细胞计数问题的解决办法
上面介绍的三种类型细胞计数方法，涵盖了现代生物医学领域细胞计数的基本技术和方法。细胞计数是要获得一个准确的细胞密度。细胞密度是单位体积内的细胞数量。计数细胞样本的体积准确，细胞数准确，密度才会准确。三种细胞计数方法，要么计数样本体积不准确（血球计数板，自动细胞计数仪），要么细胞计数不准确（流式细胞仪），所以细胞计数结果都不够准确。