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PCR扩增反应的步骤分析

更新时间:2023-07-28      浏览次数:622
PCR(Polymerase Chain Reaction),是指在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点。通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
经典的PCR扩增反应分为三步:

1、高温变性:模板DNA经加热至95℃左右一定时间后,使模板DNA双链解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;

2、低温退火:模板DNA与引物的复性,模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

3、适温延伸:DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶的作用下,以核苷酸为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

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影响扩增的因素:

1、由于各种原因,造成的PCR扩增体系中出现了非目的检测样本本身的模板,使得PCR结果出现假阳性

2、操作错误或者误差造成的模板间交叉污染

3、PCR试剂的污染

4、PCR实验器材的污染

5、PCR扩增产物的气溶胶污染


防止污染的首要原则是要设置NTC(No Template Contro|)对照,一个不含有模板DNA但含有PCR体系中所有其他成分的对照。如果不能在污染的第一时间发现,会导致后续一系列的数据无法使用。准备PCR体系的移液器要,千万不能用吸取过PCR产物的移液器去准备PCR体系。



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