上海巴玖为您讲解PCR实验的准备工作及步骤

更新时间：2021-01-11

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步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备;

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在酶的作用下，以P为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

　　重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

　
实验试剂与器材：

模板DNA、2.5mmol/L 　　q DNA聚合酶(5U/SSR引物

10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2O

PCR仪、移液枪、PCR板

实验步骤：

　　
一、实验器具与材料：

　　1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl

　　2、吸头：1ml、200μl、20μl

　　3、匀浆管：5ml

　　4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个

　　5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl

　　6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶(广口，带盖)

　　1个125ml的白色试剂瓶(放无水乙醇)

　　7、量筒：50ml、250ml、500ml

　　8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml

　　9、试管架：5ml、1.5ml、20μl

　　10、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水

　　11、铝制饭盒：4个

　　12、塑料小饭盒：1个

　　13、大瓷缸：2个

　　14、锡泊纸：一卷

　　15、卷纸：2卷

　　16、三角烧瓶：带盖，稍大

实验器具的处理与准备：

　　
1、塑料制品：(包括枪头、EP管、匀浆管等)

　　先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次(EP管)

2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用(DEPC水泡)(洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干)

3、匀浆器：(包括剪刀、镊子)先洗净后，再高压(不需要泡DEPC)

试剂配制：

1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。

2、75%乙醇：用无水乙醇 DEPC水配，然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高压)

3、异丙醇：放入棕色瓶中

4：放入棕色瓶中

5、琼脂糖