荧光定量pcr仪的使用方法

什么是数字PCR？

数字PCR是一种新的定量PCR，通过对PCR反应物进行有限稀释，随后在不同的反应腔室里进行PCR扩增，后根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例得出靶分子的起始拷贝数或浓度的技术。

什么是多重PCR？

多重PCR又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应；由Chambehian'于1988年*提出,其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。理论上只要PCR扩增的条件合适,引物对的数量可以不限,但由于各种条件的限制,实际能够扩增的引物对数量是有限的。

什么是多重数字PCR？

多重数字PCR是在同一数字PCR反应体系里加上两对或两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的数字PCR反应。将多重PCR技术与数字PCR技术有机结合而形成的多重数字PCR，根据DNA探针不同荧光度、DNA扩增不同循环数及多种标记荧光同时使用，便可大幅提高数字PCR多重性，多重性可达20-50以上，即同时在一个PCR反应单元内进行20-50个以上的数字PCR反应。

多重数字PCR在医学检测中的优势

在数字PCR中实现多指标的并行检测能显著降低检测成本，获取更丰富的检测信息。在一个PCR反应中完成基因多个突变位点的检测，即一个PCR反应即可完成一个Panel的检测，在医学领域有着不可替代的优势。

其优势可以简单概括为以下三点：

1高效性。
在同一PCR反应管内同时检出多种核酸片段，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体。

2系统性。
多重数字PCR很适宜于成组核酸片段的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌。

3经济简便性。
多种核酸片段在同一反应管内同时检出，节省时间、试剂耗材和经费，为临床提供更多更准确的检测信息。

多重数字PCR的检测类型

数字PCR的多重检测主要通过以下两种方式实现：

1、多个荧光通道。使用多种荧光染料来标记不同的要检测的靶基因。

2、单波长多强度。使用一种荧光染料，但是扩增结束时不同的靶基因对应的染料的荧光强度不一样。

多重数字PCR在临床领域的应用举例：

1.多重数字pcr技术检测肺癌EGFR基因突变

来源：Mol Med Rep.2017 Aug;16(2):1157–1166

EGFR基因突变位点的检测是指导非小细胞肺癌患者临床用药的依据。其中常见的是21号外显子L858R突变，19号外显子缺失以及20号外显子T790M突变。但是临床样本往往是有限的，尤其是液态活检样本，因此多重检测可以节省大量检测样本及检测成本。

2，多重数字pcr技术在染色体非整倍体筛查中的应用

来源：Analyst.2019 Mar 25;144(7):2239-2247

High-Precision Chromosomal Copy Number Measurement using RainDrop®Digital PCR Application Notes

数字PCR技术具有单分子灵敏度和定量的能力，能够区分微小差异，很适合用来进行无创产前检测。由于胎儿游离DNA占孕妇外周血中游离DNA很小一部分，常规实验一对引物探针要想准确分辨胎儿染色体倍数需要提高足够多的模板（约41-252ng，胎儿DNA比例10%-4%），这么大量的DNA临床一般无法提供(1ml血常规只能获得1-7ng cfDNA)，这时通过多重数字PCR设计40对引物和2个通用探针扩增21号和18号染色体上的各20个片段，就能很好的解决这个问题。结果显示以10ng cfDNA作为起始模板，使用多重数字PCR技术能够准确性分辨21-三体综合征。

3.探针成本太高，没关系我们用染料法也可以做多重数字PCR

来源：Anal Chem.2013 Dec 3;85(23):11619-27

通过改变扩增产物的长度，或者调整引物的量，或者改变反应的Tm值等条件，可以轻松尝试多重数字PCR反应。

4.染料法也可以检测点突变

染料法也可以检测SNP点突变，通过在上游引物末端添加一段序列，改变突变型或野生型扩增产物长度即可轻松实现多重检测。

 1.仪器的检测通量（Throughput）
    首先要考虑实验室目前需要使用定量PCR仪的频率。加州大学旧金山分校癌症中心的基因组分析设备负责人David Ginzinger检测过市面上绝大多数的定量PCR仪。他表示，如果不是大规模批量使用，比如说主要是用来检测验已知基因，那确实不需要昂贵的产品。但是如果是那些需要寻找新药靶点和疾病标记的实验室，就需要能容纳384孔板、运行时间更快的仪器。不过仅有这么一件高通量的仪器是不够快的，你会发现样品制备成为限速的瓶颈。所以高通量的实验室往往需要进一步的自动化仪器，只要“按一下钮”，仪器就会自动处理样品、纯化核酸和制备PCR模板。
 
   2.多重扩增的能力 
    多重扩增越来越热。实时定量PCR仪也不能幸免。定量PCR仪拥有多个检测通道，因而仪器就可以检测同一个样品槽里多个模板的扩增过程。新的LightCycler2.0 有6个检测通道，比原来多了3个。SmartCyclerⅡ有4个检测通道。以文库产品而名满天下的Stratagene也有一种价格不到Roche的一半、口碑不错的定量PCR仪Mx3000P，也就是4个检测通道。不过多重扩增并非人人适用，因为它使实验复杂化了。
 
  3．软件 
     当你准备选择一台定量PCR仪，你必须要检测附带的软件。使用方便吗，是否可以进行你所需要的分析，输出格式有几种。不过，你需要留意，太容易使用的软件是不是功能比较简单而无法进行复杂计算，以前的软件还需要你做进一步分析，新的软件已经可以处理一切了。除了基本功能，部分软件还可以有更多的功能，比如引物和探针设计、多重分析设计、背景校正、数据归一化等等。Roche应用科学部的应用和技术服务部负责人Willian Demyan 就强调：定量PCR是一个几何扩增的过程，开始时一个拷贝之差，结果就有几何数量级之别。
 
    4.灵活性 
    大规模繁忙的实验室设备*固然令人羡慕，常规的实验室同样可以有精彩的选择。现在的供应商都拥有众多的技术专家，不单了解你的目前需要，还非常周到地为你考虑了以后可能的需求变化，比如提供多种可升级配件和模块。BioRad的MyCycler就可以选择模块而升级为实时定量。ABI的定量PCR仪有多种不同的样品槽，可以将96孔槽变为双384孔槽而满足部分高通量的需求。对于刚开始小量做qPCR的实验室来说，SmartCyclerⅡ定量PCR仪是一个好选择，一个基本模块有16个独立控温样品槽，可以同时或者前后分别进行16个*独立的不同实验， “随机存取”；当实验室需要较大规模实验时，可以非常经济地升级，从1个增加到6个基本模块，也就是96样品孔。虽然不能用96孔板，但是当一个学生开始小量实验，其他人还可以随时插进去开始自己的独立实验，而且互不干扰，就是增加了灵活性。对于刚开始只做少量实验而且预算较紧张的实验室来说是非常灵活的选择。
 
    5.不确定性 
   尽管软件可以做部分修正，购买一台系统误差较少的仪器，无需那么多计算修正总比靠计算修正好。Cinzinger 就认为，要特别注意仪器样品孔之间的差异性。除了*的样品孔之间的温度差异，还有样品孔和检测探头之间光程距离、负责收发和传递信号的光纤长度的微小差别、透镜和样品孔间的距离和角度的微小差别、甚至样品槽对信号传递的影响。Cinzinger在绝大多数的市售的定量PCR仪做过同样的测试，他将同样的样品和反应试剂在仪器的每一孔进行实时扩增。很不幸，很多时候，不同样品孔之间会有不同的结果。