PCR经验总结

(首先声明，此文不如分子克隆第三版与分子克隆相背处，请信分子克隆)
增加PCR的特异性
1. primers design 
   这是重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些条件
a  足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量
b  GC% 40%~~~~60%
c  5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性
d  避免3'端GC rich, 后3个BASE不要有GC,或者后5个有3个不要是GC
   e. 避免3'端的互补, 否则容易造成DIMER
   f. 避免3'端的错配
   g. 避免内部形成二级结构
   h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值时不需要加上这些序列,但在检测互补 和二级结构是要加上它们
   i. 需要使用兼并引物时, 要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用较高的引物浓度(1uM-3uM)
   j. 学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online　desgin et al.
* 引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。 
   设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。有的是根据GC含量估算Tm。确定引物Tm可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列 结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。 
   根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果*过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比的Tm低5℃或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度**行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
2. stability of primers 
   定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制引物以干粉形式运输。好在TE重溶引物，使其终浓度为100μM。TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。 引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的引物在 -20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）多可以保存2个月。
3. optimize reactants concentration 
a. magnesiom ions
   Mg离子的作用主要是 dNTP-Mg 与核酸骨架相互作用 并能影响Polymerase的活性一般 的情况下 Mg的浓度在0.5-5mM之间调整同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液
b. 其他的离子
   NH4+ K+都会影响PCR。增加K+的浓度后, 会因为中和了核酸骨架上磷酸基团的负电荷而影响退火的温度,从而降低了PCR的 严谨性(stringency).NH4+也有相同的作用. MBI公司的TAQ酶就提供了两种BUFFER, 一种是加Mg的一种是已经混合了(NH4)2SO4的.当然, 过高的阳离子浓度(KCL>0.2M)时, DNA在94度根本不会发生变性, 当然也就无从谈起PCR了.
c. polymerase
   不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握适合的酶的浓度。一些高保真没的效率要远远低于Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些. 另外, 一般的 情况下, 变性的温度可以使用90~92度, 变性的时间也可以缩短,从而保证polymerase的活性
    d. template
    50ul PCR SYSTEM   
human gDNA 0.1ug-1ug 
    E.Coli 10ng-100ng 
    LamadaDNA 0.5ng-5ng 
    Plasmid DNA 0.1ng-10ng 
4. termperature
a. denaturation
   常规是94度5分钟, GC Rich的摸板是95度5分钟，除了GC Rich外, 常规的APPLICATIONS可以将这部分时间缩短到1到2分钟, 或者在CYCLE 1时给予较长的时间,而取消开始的denaturation
b. annealing 
   重点到了。一般情况下, 是从55度开始.根据情况配合以Mg离子浓度进行调整. 有条件的可以做gradient pcr. 退火的时间在30-60S, 时间短一些可以得到更好的效果. 因为, polymerase 在annealing temp.时也会有一些活性. 所以在A.T.的时间过长, 会极大的增加非特异性扩增的风险.另外,在对于一些困难户, 比如从gDNA里扩增大片段, 还可使用two step PCR.
5. touchdown PCR
   原理很简单,但的确是一个很有用的方法。举个例子就OK, ANNEALING TEMP. 55度
94 5min
   94 30s
   60 30s
   72 1min 2cycles
   94 30s
   59 30s
   72 1min 2cycles
   94 30s
   58 30s
   72 1min 2cycles
........
   94 30s
   51 30s
   72 1min 2cycles
  94 30s
  50 30s
  72 1min 20cycles
  72 5min
6. hot start PCR
   热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受*，如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。 限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法 简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能*消除非特异性产物的扩增。 
   热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA聚合 酶，在反应体系达到90度时，PAUSE，将温度保持在70度以上，手工加入polymerase，但这个方法 过于烦琐， 尤其是对高通量应用，并容易造成污染。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本 成分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。有很多公司提供这样的酶。
                ampliwax PCR Gems (Perkin Elmer) 
                Taq Bead Hot Start Polymerase (Promega)
                Magnesium wax beads (Stratagene).
   象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。还有一种方法是使用inactive DNA Polymerase. polymerase被抗体抑制失活，当变性温度*过70度时，抗体也变性了，这样polymerase又被激活了。
7. Booster PCR
   我们知道1ug human genomic DNA 大约在3X105幂个模板分子,这样的模板分子数目可以是引物与模板很好的结合. 当模板的浓度过低,比如低于100个分子时, 引物和模板之间就很难发生反应. 引物容易自身进行反应形成二聚体.这样就有来了个 booster PCR 我一直找不到合适的词来翻译这个booster.具体是这样的.开始几个cycles保持primer的低浓度,保证primer:template的molar ratio在10 7~ 10 8. 以确保开始扩增的准确性.然后booste Primer的浓度到正常的水平
8. 循环数和长度
   确定循环数的基本原理是: 产物能够保证你进一步分析操作的小循环数.因为过多的循环数容易造 成ERRORS和非特异性产物的积累 产物的量不够, 优化的方法有:
1.  增加TEMPLATE
2. 增加循环数
   如何确定循环数,有一个方法.做一个PCR体系,40循环,50ul, 分别在20,25,30,35循环时从体系中取5ul,一起跑电泳分析.从而确定佳的循环数另一个会影响PCR特异性的是PCR cycling时在两个温度间变化的速率(ramping rate).当然是越高 越好.不过咱们大部分条件有限,就那么几台PCR仪,也没有多少挑选的余地
9. thermal cycler
   PCR仪的因素我们经常容易忽视.长时间的使用后需要调整PCR仪,以保证其能够到达正确的温度.现在的PCR仪基本上都有自检功能(self-diagnosis).
10. PCR additives
   附加物或者说enhancer实在是多种多样. 基本上包括几类, 能够增加反应退火效率的化学因子, DNA结合蛋白和一些商业试剂. 基本的原理不外是增加引物退火特异性,减少错配, 增加产物的长度和产量.在GC Rich情况中, additive可以造成配对碱基间的的不稳定,从而提高扩增的效率.而在另一种情况下,additive由于造成错配的primer-template复合物的极大的不稳定, 而提高了扩增的忠实性.要注意的是,没有的enhancer全部通用,需要你根据自己的情况,好结合gradient pcr选择优条件.
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     dimethyl sulfoxide(DMSO) up to 10%
     formamide at 5%
     trimethylammonium chloride 10-100uM
     detergents such as Tween 20 0.1-2.5%
     polyethylene glycol (PEG)6000 5-15%
     glycerol 10-15%
     single stranded DNA binding proteins
     Gene 32 protein 1nM
     E.coli single-stranded DNA binding protein 5uM
     7 deaza-dGTP(for GC rich) 150uM with 50uM dGTP
     Taq Extehder (stratagene)
     Perfect Match PCR Enhancer(stratagene)
    Q-solution(Qiagen)
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   要注意的是,DMSO,GLYCEROL等会抑制polymerase的活性,所以需要scouting出适的浓度
11. Template DNA preparation
   提取DNA时的试剂会抑制PCR反应的顺利进行.因此需要对TEMPLATE DNA进行纯化.特别是SDS(<0.01%) 的情况下就能强烈抑制PCR的进行. 可以加入一些nonionic试剂,如Tween, Nonid, Trition之类的反过来抑制SDS. 还有proteinase K也要除干净, 不然会降解polymerase.
12. Nested PCR
   简单点说 设计两对引物, 一对是长的, 一对是包含在长引物内的, 用长引物扩增的产物作为第二次扩增的模板,这样可以增加产物的量. 而且可以减少非特异性带和错配的情况.
                                 增加PCR的保真性 
高保真酶
高温DNA POLYMERASE是以单链DNA或RNA为模板，在dNTP和一些阳离子的存在情况下，在特定的引物指导下按3'-5'方向合成DNA.包括3种类型
a.5'-3'方向的DNA合成能力,没有3'-5'方向的外切酶特性.如Taq及其突变体.这类酶的合成能力强,因为他不纠正合成中出现的突变
   b.与a类似,有合成活性,没有3-5的外切活性.但他们能以RNA为模板,合成DNA. 如Tth DNA Polymerase
   c.有DNA聚合活性,没有逆转录活性,但有3-5方向的外切酶活性.如pfu DNA Polymerase.可以提高忠实性。但是这些聚合酶的产量比Taq DNA聚合酶低。
酶的混合物
将Taq DNA聚合酶同带有3'到5'外切核酸酶活性第二种聚合酶混合在一起可以获得比单独Taq DNA聚合酶高的忠实性，并可以得到高产量及扩增长模板。
其他因素
除了酶，高浓度的dNTP或镁离子会降低忠实性。将dNTP的浓度从200μM降低到25-50μM可以增加度如果四种核苷的浓度不同，忠实性会受影响。进行较少的PCR循环也会有助于增加忠实性，因为增加循环数目和产物长度就会增加突变可能性。