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凝胶成像分析系统的组成及用途

更新时间:2017-02-06      浏览次数:8409

 

 

一、凝胶成像分析系统的组成
    凝胶成像系统的基本组成包含:CCD相机、镜头、暗室和分析软件。不过其功能不仅于对琼脂糖凝胶进行成像,现在的成像仪趋向于多功能化,还适用于蛋白胶、核酸、多肽、氨基酸、多聚氨基酸、印迹膜和菌落平板等应用。在Western Blot方面,高性能的化学发光成像系统能与胶片媲美。

二、CCD
    CCD是电荷耦合器件(Charge Coupled Device)的英文名称缩写,是一种光电转换器件。是凝胶成像系统的核心部件。绝大多数对数码相机都有一定的了解,不少人还是这方面的专家。有人把数码相机的像素看得很重,但比较之后发现,有些400万、500万像素的相机拍出来的片子没有300像素的机子拍出来的好,这是为什么?其实,影响成像的因素很多,衡量CCD好坏的指标,有分辨率,CCD尺寸,动态范围,灵敏度,量子效率,信噪比等,其中像素数以及CCD尺寸是重要的指标。其实是说感光器件的面积大小,这里就包括了CCD感光器件的面积越大,也即CCD面积越大,捕获的光子越多,感光性能越好,信噪比越低。
为了方便您更了解CCD的大小,现列举目前市场上所应用的CCD规格如下:
1英寸——靶面尺寸为宽12.7mm*高9.6mm,对角线16mm.
2/3英寸——靶面尺寸为宽8.8mm*高6.6mm,对角线11mm.
1/2英寸——靶面尺寸为宽6.4mm*高4.8mm,对角线8mm.
1/3英寸——靶面尺寸为宽4.8mm*高3.6mm,对角线6mm.
1/4英寸——靶面尺寸为宽3.2mm*高2.4mm,对角线4mm.

三、制冷CCD
    相同满井电子的CCD,降低CCD噪音,就能提高CCD的检测能力,热或者暗电流对于CCD都是噪音,噪音在Cool CCD基本都可以被深度致冷的Peltier消除。在曝光*过5-10秒,CCD芯片就会发热,没有制冷设备的芯片,“热”或者白的像素点就会遮盖图像,图像到处可见雪花。CCD结构设计、数字化的方法等都会影响噪音的产生。当然通过改善结构、优化方法,同样能减少噪音的产生。
制冷CCD的适用性:荧光及化学发光本身较弱,所以对CCD噪音的降低要求很高,应选用高分辨率数字制冷CCD相机结合高通透镜头系统,使其能够捕获到信号极其微弱的荧光及化学发光样品图像,并且能够较为大程度的降低噪音,减少背景,提供出色的图像清晰度。另外可选激发光源及多位滤镜轮扩大了荧光/化学发光成像的应用范围。所以一般在荧光及化学发光观察时需要选择制冷CCD。所以制冷CCD相机是分子影像成像分析系统的未来的发展趋势和必须要求。

(1)、分辨率
    分辨率的大小和像素值是分不开的,像素指得是CCD能分别的较为小的感光元件,我们平时说的多少万像素就是这些感光元件的个数了。所以一般来讲像素越多,成像也就越清晰细腻,当然这其中还要受许多因素限制,下面会慢慢提到的。但是高像素也不一定是好的CCD,其原因就是像素大小(Pixel Size),也是很重要的因素,相同数目的像素,排列越密集,像素之间就越容易出现电流干扰,容易出现"噪点"等干扰成像质量的现象出现。由于制造工艺的限制,增加尺寸,成本将会以几何级数提高。
现在大部分厂家的CCD为了提高图像的灵敏度,会使用像素合并的技术,那么像素合并的意义是什么呢?
像素合并是一种非常有用的功能,它可被用来提高像素的大小和灵敏度,如CCD分辨率为1392X1040,像素大小为6.45um,当经过2X2合并后,分辨率变成696X520,像素大小为12.9um.但经过4X4合并后,分辨率只有348X260,分辨率太小,在实际应用中就没有太多意义了。

(2)、动态范围值
    动态范围表示在一个图像中较为亮与较为暗的比值。

      灰阶表示在一种表征光亮度的方法,12bit表示从较为暗到较为亮等分为2^12=4096个级别,16bit即为2^16=65536个级别,可见bit值越高能分出的细微差别越大. 

      12bit与16bit在图像分辨上的区别

   对动态范围进行量化需要一个运算公式,即动态范围值 = 20 log (well depth/read noise),其中Well depth代表是满井电子,是CCD饱和时能接受的电子信号总值,read noise是读出噪声(以电子数来表示),每个CCD在读数的过程中都会产生噪声,噪声越小,监测灵敏度越高。其中满井电子与CCD的bit值是相关的,通常下,bit值越高,满井电子的数值越大。
举例如下:
Well depth = 85,000 个电子, read noise = 12 个电子
Dynamic range = 20 log (85,000/12), or 77dB.
动态范围的值越高CCD性能越好.

(3)、量子效率  
    CCD的量子效率也称像素灵敏度,指在一定的曝光量下,像素势阱中所积累的电荷数与入射到像素表面上的光子数之比。不同结构的CCD其量子效率差异很大。比如100光子中积累到像素势阱中的电荷数是50个,则量子效率为50%(100 photons = 50 electrons means 50% efficiency)。值得注意的是CCD 的量子效率与入射光的波长有关。

(4)、信噪比
    说到信噪比就不得不提到暗电流了,
暗电流是导致CCD噪音的很重要的因素。暗电流指在没有曝光的情况下,在一定的时间内,CCD传感器中像素产生的电荷。我们在做化学发光检测的时候,需要的曝光的时候比较长,这样导致CCD产生较多的暗电流,对图像的质量影响非常大。通常情况下通过降低CCD的温度来较为大限度的减少暗电流对成像的

    影响。CCD产生的暗电流随着温度下降而减少,但是在-23℃下开始趋于平缓,由此可以得出温度并非需要无休止的降低的。所以在选择冷CCD时,温度在-25℃(温度,非室温以下)下一般就可以达到您的要求了。
    有的CCD是在图像较为终生成后,通过软件去背景来扣除暗电流,对于信号远远强于背景的有一定效果,但是对于弱信号处理过程中会产生越来越多的错误。

   
 
(5)、光学镜头
    光学镜头是机器视觉系统中*的部件,直接影响成像质量的优劣,影响算法的实现和效果。光学镜头规格繁多,有时不免头晕。光学镜头从焦距上可分为短焦镜头、中焦镜头,长焦镜头;从视场大小分有广角、标准,远摄镜头;结构上分有固定光圈定焦镜头,手动光圈定焦镜头,自动光圈定焦镜头,手动变焦镜头、自动变焦镜头,自动光圈电动变焦镜头,电动三可变(光圈、焦距、聚焦均可变)镜头等。

(6)滤光镜片
    荧光:EB 、TLC plates、GFP plates、SYBR Green、SYBR Gold、SYBR Safe、SYPRO Red、SYPRO Orange、Texas Red、Rhodamine Red、Fluorescein、Deep Purple、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、荧光板等
   (要根据具体的激发光源和滤镜来决定)


光源

激发波长

吸收波长

染料

Blue

475nm

537nm

SYBR Green、SYBR Gold、SYBR Safe、SYPRO Orange、Cy2等

Green

534nm

606nm

SYPRO Red、Cy3等

Red

632nm

609nm

Texas Red、Rhodamine Red 、Cy5等

 

凝胶成像系统特点:

  1. 暗箱模具成型,小巧美观、抗干扰、密封性好!
  2. 专业化凝胶图像分析软件,全中文操作界面,自动识别8 bit、10bit、12 bit、16 bit图像,友好的人机界面,操作简便,功能强大,可对凝胶图像进行采集、编辑、分析及管理
  3. 日本原装高分辨率变焦光学镜头
  4. 安全实用的凝胶切割工作装置
  5. 全电脑控制所有操作过程,高度程序化(电脑控制暗箱/紫外及白光/光圈/变焦/焦距)
  6. 定时关机:用户可自行设定定时关闭紫外光源的时间
  7. 拍摄范围:较为大成像面积21cm×26cm
  8. 光源:多个辅助光源包括紫外透照,白光透照,紫外反射,白光反射等

主要功能:

  1.凝胶图像剪辑处理,标记;

  2.自动寻找凝胶条带;

  3.与公用的标准条带或自选的标准条带比较;

  4.条带(泳道)迁移路径的校正;

  5.核酸、蛋白的处理,计算相应的分子量等数值;

6.详细的分析结果可输出成EXCEL格式,根据需要编辑。

 

适用范围:

 

从整体总的来说凝胶成像(系统)可应用于:蛋白质、核酸、多肽、氨基酸、多聚氨基酸等其他生物分子的分离纯化结果作定性分析

  (1)分子量定量

  对于一般常用的DNA胶片,利用分子量定量功能,通过对胶上DNA Marker条带的已知分子量注释,自动生成拟合曲线,并以它衡量得到未知条带的分子量。通过这种方法所得到的结果较肉眼观察估计要准确很多。

  (2)密度定量

  一般常用的测定DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)浓度的方法是紫外吸收法,但它只能测定样品中的总核苷酸浓度,而不能区分各个长度片段的浓度。利用凝胶成像系统和软件,先将DNA胶片上某一已知其DNA含量的标准条带进行密度标定以后,可以方便的单击其他未知条带,根据与已知条带的密度做比较,可以得到未知DNA的含量。此方法也适用于对PA GE蛋白胶条带的浓度测定。

  (3)密度扫描

  在分子生物学和生物工程研究中,我们较为常用到的是对蛋白表达产物占整个菌体蛋白的百分含量的计算。传统的方法就是利用的密度扫描,但利用生物分析软件结合现在实验室常规配备的扫描仪或者直接用白光照射的凝胶成像就能完成此项工作。

  (4)PCR定量

PCR定量主要是指,如果PCR实验扩增出来的条带不是一条,那么可以利用软件计算出各个条带占总体条带的相对百分数。就此功能而言,与密度扫描类似,但实际在原理上并不相同。PCR定量是对选定的几条带进行相对密度定量并计算其占总和的百分数,密度扫描时并对选择区域生成纵向扫描曲线图并积分。

 

凝胶成像的分类:

 (1)普通凝胶成像分析系统:可以对蛋白电泳凝胶,DNA凝胶样品进行图象采集并进行定性和定量分析,样品包括:EB、SYBR Green、SYBR Gold、Texas Red、GelStar、Fluoroscecin、Radiant Red等染色的核酸监测;以及Coomassie Blue、SYPRO Orange、各种染色的蛋白质凝胶如考染等。(或UV,EB和有色及可见样品成像);

  (2)化学发光成像分析系统:成像范围涵盖UV,EB,化学发光、紫外-荧光、有色及可见样品成像;

  (3)多色荧光成像分析系统:成像范围涵盖UV,EB,化学发光、多色荧光荧光、有色及可见样品成像;

  (4)多功能活体成像分析系统:UV,EB,化学发光、多色荧光荧光、有色及可见样品成像和离体组织和小型动物,及大型型动物。

   

较为后是品牌推荐:

  进口品牌美国的市场上见的是相对比较多的有:UVP、伯乐、alpha、SIM、KODAK、GE、Wealtec等;德国品牌主要有:Royal、Raytest等;英国品牌:UVI、Fedbio等;以色列DNR;荷兰Isogen等等。目前这些国内进口品牌和国产品牌的市场差不多,但是价格肯定是高于国产品牌。

中国本土企业也掌握了凝胶成像核心技术,性能方面不比进口差,价格又比进口的低,本土的品牌大致上可见:北京六一、君意东方、上海领成、上海培清、上海山富、上海复日、上海嘉鹏、上海勤翔、江苏捷达等品牌。

 


 

 

   


 

 

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